Sie entscheidet maßgeblich mit über die Öffnungsrate. Eine Erfolgsregel lautet: Wichtige Reizworte gehören nach vorn, da vom Betreff nur eine bestimmte Zeichenzahl dargestellt und der Rest abgeschnitten wird. Wie viele Zeichen der Abonnent tatsächlich sieht, variiert je nach E-Mail-Programm. Ebenso gilt der Grundsatz "Klarheit vor Erfindungsreichtum und Wortwitz", denn der Leser überfliegt den Inhalt nur kurz. Da die Betreffzeile einen starken Hebel auf die Öffnungsrate ausüben kann und zugleich leicht zu variieren ist, ist sie häufigster Gegenstand von A/B Tests. Zahlreiche Studien untersuchen, welche Reizworte und Betreffzeilenlängen die größten Responsesteigerungen versprechen. Seit ca. 2012 experimentieren zunehmende mehr Versender mit auffälligen Unicode-Symbolen in der Betreffzeile.